几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖的降解效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (34): 6152-6158.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.014

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几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖的降解效应

曹文帅，邓婧，徐全臣，朱元祺

青岛大学医学院附属医院口腔内科，山东省青岛市 266003

出版日期:2013-08-20 发布日期:2013-08-20
通讯作者: 徐全臣，主治医师，青岛大学医学院附属医院口腔内科，山东省青岛市 266003 xuqch@yahoo.com.cn
作者简介:曹文帅，男，1986年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主要从事口腔内科牙周方向研究。 Caowenshuai1986@qq.com 共同第一作者：邓婧，女，1963年生，主任医师，教授，主要从事口腔内科牙体牙髓病、牙周病病因及防治的研究。
基金资助:
青岛市公共领域科技支撑计划项目(KZJ-26)。

Degradation of carboxymethyl chitosan by several common periodontal pathogens

Cao Wen-shuai, Deng Jing, Xu Quan-chen, Zhu Yuan-qi

Department of Oral Medicine, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Online:2013-08-20 Published:2013-08-20
Contact: Xu Quan-chen, Attending physician, Department of Oral Medicine, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China xuqch@yahoo.com.cn
About author:Cao Wen-shuai, Studying for master’s degree, Department of Oral Medicine, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Caowenshuai1986@qq.com. Deng Jing, Chief physician, Professor, Department of Oral Medicine, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Cao Wen-shuai and Deng Jing contributed equally to this work.
Supported by:
Qingdao Public Domain Project for Supporting Science and Technology, No. KZJ-26*

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，羧甲基壳聚糖的体内降解已成为牙周组织工程和材料学领域中的研究热点，但在涉及羧甲基壳聚糖酶解的文献中，尚未找到关于牙周致病菌能够产酶降解羧甲基壳聚糖的报道。

目的：研究几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖的降解作用。

方法：制备质量分数1%和2%的羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基。采用透明圈法，分别挑取牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和黏性放线菌菌落划线接种于羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基中，置于厌氧培养袋中37 ℃恒温培养，观察结果，如果菌落周围出现明显的透明圈，即为阳性，说明细菌能够分解羧甲基壳聚糖，反之则为阴性，并测量菌落直径。

结果与结论：牙龈卟啉单胞菌在1%羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基上生长良好，培养18 d后菌落周围出现明显的透明圈；在2%羧甲基壳聚糖培养基上，牙龈卟啉单胞菌的生长受到抑制，未形成形态规则的菌落；伴放线放线杆菌和黏性放线菌在两种质量分数羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基中，菌落周围均未出现透明圈，培养2周后菌落干枯失去活性。提示牙龈卟啉单胞菌可降解较低质量分数的羧甲基壳聚糖，伴放线放线杆菌和黏性放线菌均不能降解羧甲基壳聚糖。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 膜生物材料, 羧甲基壳聚糖, 牙周致病菌, 牙龈卟啉单胞菌, 壳聚糖酶, 透明圈, 菌落

Abstract:

BACKGROUND:In recent years, the degradation in vivo of carboxymethyl chitosan has become a research focus in the fields of periodontal tissue engineering and materials science. However, in the literature involving carboxymethyl chitosan enzymatic degradation, there is no report regarding whether common periodontal pathogens could degradate carboxymethyl chitosan.

OBJECTIVE: To study the degradation of carboxymethyl chitosan by several common periodontal pathogens.

METHODS: 1% and 2% carboxymethyl chitosan anaerobic microbiological culture media were prepared. The colonies of Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitan and Actinomyces viscosus were picked up streaking onto the carboxymethyl chitosan medium, respectively, which was then incubated in anaerobic culture bag at 37 ℃. If the see-through circle appeared around the colonies, the result was positive, indicating that the bacteria can degradate carboxymethyl chitosan; on the contrary, it was negative. Afterwards, the diameter of the colonies was measured.

RESULTS AND CONCLUSION: It was observed that the colonies of Porphyromonas gingivalis grew well in the 1% carboxymethyl chitosan medium and the see-through circles appeared around the colonies after incubation for 18 days; meanwhile, the medium containing 2% carboxymethyl chitosan inhibited the growth of Porphyromonas gingivalis and the standard morphological colonies did not form well. The see-through circle did not appear around the colonies of Actinobacillus actinomycetemcomitan and Actinomyces viscosus in the two concentrations of carboxymethyl chitosan media and the colonies were dried-up and lost activity after 2-week incubation. The results indicated that the lower concentration of carboxymethyl chitosan could induce Porphyromonas gingivalis to produce chitosanase and degradate carboxymethyl chitosan. Neither Actinobacillus actinomycetemcomitan nor Actinomyces viscosus could degradate carboxymethyl chitosan.

Key words: biomaterials, biomaterials and drug controlled release, membrane biomaterials, carboxymethyl chitosan, periodontal pathogens, Porphyromonas gingivalis, chitosanase, see-through circle, colonies

中图分类号:

R318

曹文帅，邓婧，徐全臣，朱元祺. 几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖的降解效应[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6152-6158.

Cao Wen-shuai, Deng Jing, Xu Quan-chen, Zhu Yuan-qi . Degradation of carboxymethyl chitosan by several common periodontal pathogens[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6152-6158.

图/表（结果） 5

2.1 羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基的特性 结果见图1。

1%羧甲基壳聚糖培养基呈浅棕黄色，透明均一，无杂质，pH值7.4。2%羧甲基壳聚糖培养基的颜色深于1%羧甲基壳聚糖培养基。含琼脂粉的空白对照培养基呈淡黄色，透明均一，无杂质，pH值7.2。
2.2 纯化培养后3种牙周致病菌的菌落形态及生理生化特征 3种菌株在厌氧微生物分离培养基上经纯化培养后，四五天可见有微小菌落形成，10-12 d菌落形态达到稳定。通过菌落形态观察及活菌涂片观察，得到图2及表1的结果。

菌落生理生化实验特征结果见表2。
2.3 羧甲基壳聚糖透明圈实验结果见图3。培养18 d后，在空白对照组培养基上，牙龈卟啉单胞菌菌落呈干枯状，失去活性；在1%羧甲基壳聚糖培基上，牙龈卟啉单胞菌菌落生长良好，菌落周围出现明显的透明圈；在2%羧甲基壳聚糖培基上，牙龈卟啉单胞菌未长出形态规则的成熟菌落，其生长受到抑制。伴放线放线杆菌和黏性放线菌在两种质量分数羧甲基壳聚糖培养基中菌落周围均未出现透明圈，菌落生长至2周时呈干枯状，失去活性。

2.4 不同质量分数羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基对3种牙周致病菌菌落直径的影响 3种细菌接种开始的三四天，细胞处于生长缓慢的潜伏期，此时可见有微小的菌落形成；随后第五六天进入快速生长的对数期，第8天进入生长的平台期，菌落形态达到稳定状态，此时，每个培养基随机选取20个发育完好的菌落，用游标卡尺测量菌落直径，测量数据经过单因素方差分析，菌落直径比较见表3。

结合图2、表1、表2的菌株形态特征和生理生化特征，符合《伯杰细菌鉴定手册》(第九版，1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(1999年)的对这3种细菌的形态学和生理生化性状的描述，可以确定这3种细菌的纯种性。由表3可见，空白对照组中3种牙周致病菌菌落的直径较大，在含羧甲基壳聚糖的培养基中菌落直径有不同程度减小，特别是2%羧甲基壳聚糖对3种牙周细菌均有较强的抑制作用，使牙龈卟啉单胞菌和黏性放线菌无法形成正常菌落，未能测得菌落直径。两种羧甲基壳聚糖培养基中的菌落直径与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，证明羧甲基壳聚糖对3种牙周致病菌有不同程度的抑菌作用。

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引言

牙周组织工程是利用组织工程的原理与技术来促进牙周组织细胞的增殖与分化，使之形成新的牙周膜及牙槽骨等，从而修复和再生牙周支持组织^[1-2]。在牙周组织工程中对牙周组织工程材料的研究尤为关键。理想的牙周组织工程材料需要具备良好的生物相容性及足够的机械强度，并且能够在体内逐步降解，为新生细胞和组织的生长提供空间^[3]。在众多的牙周组织工程候选材料中，因羧甲基壳聚糖具有的水溶性、抑菌性、可降解性及良好的生物相容性等诸多优点，一直以来是学者们研究的焦点^[4-6]。之前的实验已经证实，羧甲基壳聚糖在人体内的降解主要是酶解过程^[7]，人体体液中的组织蛋白酶B、脂肪酶、胃蛋白酶、溶菌酶等均能够水解羧甲基壳聚糖^[8-9]。但是，在这些研究中学者们大多将注意力集中在对羧甲基壳聚糖的体内降解研究这一方面，而忽视了存在于牙周组织中的某些牙周致病菌是否也对羧甲基壳聚糖有降解作用。某些牙周致病菌是否能分解以羧甲基壳聚糖为材料的牙周组织工程植入物，并将其作为营养底物促进自身生长？某些牙周致病菌是否能加快羧甲基壳聚糖牙周植入材料的降解速度？这些结论将影响羧甲基壳聚糖在牙周领域的应用前景。细菌主要依靠其分泌的壳聚糖酶降解利用壳聚糖及其衍生物。壳聚糖酶在真菌、细菌、霉菌和病毒中都曾被发现^[10-12]，但目前尚未找到有关于常见牙周致病菌能产生壳聚糖酶降解羧甲基壳聚糖的文献报道。鉴定某种细菌能否分泌壳聚糖酶，判断其对壳聚糖是否具有降解作用的一种简便直观的方法是“壳聚糖透明圈实验”^[13]。实验将壳聚糖透明圈实验的原理和方法应用于鉴定常见牙周致病菌能否降解羧甲基壳聚糖的这一研究中，并创新为“羧甲基壳聚糖透明圈实验”，目的旨在研究某些常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖是否有降解作用，为将来羧甲基壳聚糖的实际临床应用提供参考依据。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011年11月至2012年10月在青岛大学医学院附属医院检验科细菌室完成。

材料：

实验菌种：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g,ATCC 33277)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitan,A.a,ATCC 29523)、黏性放线菌(Actinomyces viscosus,A.v,ATCC 19246 )，这3种菌株的冻干粉均由首都医科大学附属口腔医院口腔医学研究所提供。

几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖降解作用实验的主要试剂及仪器：

实验器材都经过高压蒸汽灭菌，所有实验操作在生物安全柜中进行。

实验方法：

羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基的制备：参照文献[13]的方法略加修改。用分析天平准确称取2.0 g羧甲基壳聚糖粉倒入100 mL蒸馏水中，室温(23±1) ℃连续搅拌直至完全溶解，密封备用。将3.9 g PDA厌氧微生物培养基基质溶解于100 mL蒸馏水中，缓慢倒入上述羧甲基壳聚糖溶液，连续搅拌，使之混合均匀，调节pH值至中性。3 000 r/min离心10 min除去杂质，取上清液，经121 ℃高压灭菌15 min，分装到培养皿中冷却凝固后即得到羧甲基壳聚糖质量分数为1%的厌氧微生物培养基。以上述相同的方法制备羧甲基壳聚糖质量分数为2%的厌氧微生物培养基。以2.0 g琼脂粉替代羧甲基壳聚糖粉，制作空白对照组培养基。

实验分组：实验分为3组：1%羧甲基壳聚糖培养基组、2%羧甲基壳聚糖培养基组、空白对照组。以上述方法，每组分别制作30个培养基。每组的30个培养基以每10个为一小组，分别接种牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、黏性放线菌。

几种常见牙周致病菌对羧甲基壳聚糖降解作用实验的分组：

菌种的复苏及培养：将3种菌株的冻干粉解冻后用无菌蒸馏水稀释，振荡30 min，使菌株冻干粉充分打散后，分别注入厌氧微生物培养瓶中，37 ℃摇床培养72 h。用无菌注射器吸取0.5 mL培养液轻轻接种到厌氧微生物分离培养基上，划线，置于厌氧培养袋中37 ℃恒温培养6-8 d，观察菌落的生长情况。

菌种的纯化^[14]：为确保这3种菌株的可靠性，避免菌株中混入其他可能产生壳聚糖酶的细菌，实验将这3种菌株多次进行分离纯化培养并做纯种鉴定。具体方法为：待菌落形成后，用无菌接种环挑取生长良好、形态规则的单个菌落，划线接种到厌氧微生物分离培养基上，置于厌氧袋内37 ℃恒温培养6-8 d。待新菌落长成后再挑取生长良好的单个菌落，继续采用划线分离法对菌落纯化传代培养2次。

菌种的形态特征与生理生化特征鉴定： ①菌种的形态特征及革兰染色^[15]：观察并记录菌落形态特征。挑取单个菌落涂片、干燥、固定。加结晶紫染色1.0-2.0 min，水洗。用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min，水洗。用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，加体积分数95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。用番红液复染约2 min，水洗。干燥后用油镜观察。②菌种的生理、生化特征测定：参照文献[16]的测试方法，对3种细菌分别进行了一系列生理生化测试。测试项目包括葡萄糖发酵实验、蔗糖发酵实验、乳糖发酵实验、氧化酶实验、过氧化氢酶实验、产氨实验、产硫化氢实验等。本测试由青岛大学医学院附属医院检验科细菌室专家完成。

羧甲基壳聚糖透明圈实验：其原理是：羧甲基壳聚糖平板呈不透明状，能利用羧甲基壳聚糖的微生物必然会分解羧甲基壳聚糖成小分子，使菌落周围形成透明圈^[13]。用无菌接种环分别挑取上述纯化培养的3种细菌单个菌落，用无菌蒸馏水稀释，制成浓度为10⁶ CFU/mL的菌悬液。用无菌微量注射器吸取0.5 mL菌悬液轻轻接种于质量分数1%和2%羧甲基壳聚糖厌氧微生物培养基以及空白对照组培养基中，划线，将培养基置于厌氧培养袋中37 ℃恒温培养，观察结果。

菌落直径测量：每个培养基随机选取20个发育完好的菌落，用游标卡尺(精密度0.01 mm)测量菌落直径。

主要观察指标：培养基中3种细菌菌落形态及直径，菌落周围是否出现透明圈。

统计学分析：用SPSS 16.0软件完成统计学处理，对测量的各组菌落直径进行统计学分析，确定羧甲基壳聚糖浓度与菌落直径之间的关系。所有实验数据采用所有数据用x(_)±s表示，符合方差齐性检验后采用单因素方差分析，析因分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验所选用的3种细菌都是具有代表性的牙周致病菌，其中牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌均为革兰阴性、专性厌氧菌，是目前公认的牙周炎主要致病菌。牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎的发病中具有重要意义；伴放线放线杆菌在龈下菌斑中广泛存在，与侵袭性牙周炎密切相关，伴放线放线杆菌为兼性厌氧菌，是龈下菌斑中经常分离到的细菌，被认为与牙周炎的进展有关^[17-19]。此外，实验为了确保这3种菌株的可靠性，避免这3种菌株的冻干粉中混入其他可能产生壳聚糖酶的细菌，造成错误的实验结果，实验中采用专性厌氧菌分离培养基，将这3种菌株在复苏培养后进行多次纯化，最后得到纯种菌落。对这3种细菌菌落通过菌落特征、生理生化试验等检测都证明了它们的可靠性。大多数由细菌产生的壳聚糖酶是一种诱导酶，在细胞正常代谢活动中微量合成或不合成，只有在适当底物的诱导下壳聚糖酶才会大量合成。一般来说，水溶性壳聚糖都能诱导微生物产生壳聚糖酶^[8]。在实验中最初将这3种菌株直接接种于以羧甲基壳聚糖为惟一碳源的厌氧微生物培养基中，但在实验过程中发现细菌并不生长。这可能是由于牙周细菌的生长需要严格的营养条件，而单一碳源的培养基不能满足细菌生长所需要的营养条件。因此，作者将以羧甲基壳聚糖作为惟一碳源改良为以羧甲基壳聚糖为主的复合型碳源，并加入了微量的酵母提取物、维生素K、动物血清等营养成分，使这几种牙周致病菌能先利用其他碳源生长，待碳源不足以满足细菌的生长需求后，由羧甲基壳聚糖作为碳源诱导产酶。由于羧甲基壳聚糖培养基中的营养成分不是很丰富，这3种细菌在羧甲基壳聚糖培养基中的生长速度比在空白对照组培养基中的慢。最终，牙龈卟啉单胞菌菌落在1%羧甲基壳聚糖培养基上生长稳定，菌落形态规则，在培养18 d后菌落周围出现明显的透明圈；在2%羧甲基壳聚糖培基上，牙龈卟啉单胞菌生长受到抑制，未长出形态规则的成熟菌落。推测牙龈卟啉单胞菌能够在较低质量分数(1%)的羧甲基壳聚糖诱导下产生壳聚糖酶，降解羧甲基壳聚糖作为其自身生长所需的营养物质；而当羧甲基壳聚糖的质量分数增加到一定程度，羧甲基壳聚糖诱导牙龈卟啉单胞菌产酶的作用就会被抑制，其抑菌作用表现出来。这与王宏钦等^[20]研究结论相似，壳聚糖在一定质量分数内(小于1%)能诱导自筛菌株产生壳聚糖酶，超过一定质量分数(大于1%)后则会对菌株产酶有抑制作用。随后，Jiang等^[21]的实验结果也得出壳聚糖含量在0.25%-0.85%时，诱导细菌产壳聚糖酶的效果最好，在小于0.25%和大于0.85%时其产酶受到抑制。并初步分析其原因认为当壳聚糖含量低于0.25%时，维持细菌生长的营养物质缺乏，不足以维持细菌的正常生长。而当壳聚糖含量高于0.85%时，由于羧甲基壳聚糖黏度过高不利产酶；再者，羧甲基壳聚糖含量过高其抑菌性表现出来，抑制细菌生长。理想的组织工程材料应是可吸收的，在组织形成过程中逐渐分解。作为可降解材料的羧甲基壳聚糖，必须要控制其在体内的降解速度，使它在牙周组织内存留预定的时间，待完成特定的功能之后，才降解排出体外，因此有必要对羧甲基壳聚糖在牙周组织内的降解性能进行研究。在牙周组织工程方面，要求牙周植入物能够达到足够长的作用时间，并在组织形成过程中逐渐分解，从而不影响新形成组织的结构和功能，降解速度与组织再生的速度相匹配，以便牙周组织再生与重新附着^[22]。以往的研究表明，牙周韧带细胞的移动、分裂和增殖约在3周完成，牙槽骨缺损的修复需要8-10周的时间^[23]。羧甲基壳聚糖作为牙周组织工程材料植入体内的置留时间为6-15周不等^[24]。而在实验中羧甲基壳聚糖培养基中出现透明溶解环的时间是在大约第3周。由于牙龈卟啉单胞菌的存在，可能会加速羧甲基壳聚糖牙周植入物的降解，使之达不到预定的置留时间，影响羧甲基壳聚糖牙周组织工程植入材料的远期效果。而当羧甲基壳聚糖作为药物载体植入到牙周袋内时，药物从羧甲基壳聚糖载体中完全释放的时间应接近于羧甲基壳聚糖载体在牙周袋内降解的时间。如果在药物完全释放后，羧甲基壳聚糖载体在牙周袋内继续置留的时间过长，则可能会被残存的牙龈卟啉单胞菌降解，作为牙龈卟啉单胞菌自身的营养物质，反而促进该菌的生长。实验结果显示，空白对照组中3种牙周致病菌的菌落直径最大，在含有不同质量分数羧甲基壳聚糖的培养基中菌落直径有不同程度降低，特别在2%羧甲基壳聚糖培养基中菌落直径降低最明显，明显低于空白对照组和1%羧甲基壳聚糖培养基组(P < 0.01，P < 0.05)，甚至使牙龈卟啉单胞菌和黏性放线菌无法正常生长，未能长出菌落。实验证明了羧甲基壳聚糖对这3种牙周致病菌的抑制作用，并且羧甲基壳聚糖的抑菌能力随浓度增大而增强。这与以往研究结论相一致^[25]。实验初步证明了牙周致病菌中的牙龈卟啉单胞菌能够降解低质量分数的羧甲基壳聚糖。因此，牙周炎患者必须在彻底清除龈下菌斑后才可在体内植入以羧甲基壳聚糖为材料的药物载体或者牙周组织工程材料，以避免被龈下菌斑中残存的牙龈卟啉单胞菌降解。但是，除了以上这3种主要的牙周病原菌以外，龈下菌斑中的其他微生物种类还有很多，龈下菌斑又是一个非常复杂的微生态环境，各种细菌之间存在着复杂的联系，并不象体外实验环境这么单一。因此，龈下菌斑中的其他细菌是否对羧甲基壳聚糖有降解作用等问题尚需进一步研究。

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